在生命科學研究和生物制藥領域，蛋白質的高效純化是獲取高純度、高活性目標蛋白的關鍵步驟。柱層析技術作為蛋白純化的核心手段，憑借其操作簡便、分離效率高、可規模化放大等優勢，被廣泛應用于實驗室研究和工業生產中。根據分離原理的不同，蛋白純化柱層析主要可分為離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析和疏水相互作用層析四種主流方法，每種方法都有其原理、操作要點和適用場景。

 

 

　　離子交換層析是基于蛋白質表面電荷與層析介質上帶電基團之間的靜電相互作用實現分離的技術。在特定的 pH 環境中，蛋白質會攜帶不同性質和數量的電荷，當樣品溶液流經填充有離子交換樹脂的層析柱時，帶相反電荷的蛋白質會與樹脂表面的功能基團結合，而不帶電荷或電荷相同的蛋白質則直接流出。通過改變洗脫液的離子強度或 pH 值，可使結合在樹脂上的蛋白質按照親和力從弱到強的順序依次洗脫下來，從而達到分離純化的目的。該方法對蛋白質的分辨率較高，尤其適用于分離等電點差異明顯的蛋白質混合物，在重組蛋白的初步純化階段應用廣泛。
 

　　凝膠過濾層析，又稱分子篩層析，其分離原理基于蛋白質分子的大小差異。層析柱內填充的凝膠顆粒具有均勻的多孔結構，當蛋白質混合物流經層析柱時，小分子蛋白質能夠進入凝膠顆粒內部的孔隙中，流經路徑較長，保留時間較長；而大分子蛋白質無法進入孔隙，只能沿著凝膠顆粒之間的間隙流動，流經路徑較短，先被洗脫出來。這種按分子大小進行分離的方式具有條件溫和、不改變蛋白質活性的優點，常用于蛋白質的脫鹽、分子量測定以及去除樣品中的小分子雜質。在蛋白純化的后期階段，凝膠過濾層析常被用于進一步純化和調整蛋白溶液的緩沖體系。
 

　　親和層析是一種利用生物分子間特異性相互作用進行分離的高效方法，其核心在于層析介質上固定的配體與目標蛋白之間的專一性結合。例如，抗原與抗體、酶與底物、生物素與鏈霉親和素等都可作為親和配對系統。當樣品溶液通過層析柱時，目標蛋白會與配體特異性結合而被保留在柱上，其他雜蛋白則隨流動相流出；之后通過改變洗脫條件(如加入競爭性配體或調整 pH 值)，可將目標蛋白從柱上洗脫下來。親和層析具有高的選擇性和純化效率，一步純化即可達到很高的純度，是純化帶有標簽的重組蛋白的方法。
 

　　疏水相互作用層析基于蛋白質表面的疏水基團與層析介質上的疏水配體之間的疏水相互作用實現分離。在高離子強度的溶液中，蛋白質表面的疏水區域會暴露出來，與疏水介質結合；隨著洗脫液離子強度的降低，疏水相互作用減弱，蛋白質按照疏水性從弱到強的順序被洗脫。該方法適用于分離疏水性差異較大的蛋白質，常與離子交換層析配合使用，在蛋白純化的中間階段去除大量雜蛋白。